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        重磅!國家藥監局發(fā)文,干細胞產(chǎn)品和檢測相關(guān)需重點(diǎn)關(guān)注

        2023年10月7日,國家藥品監督管理局發(fā)布《關(guān)于公開(kāi)征求《人源干細胞產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導原則(征求意見(jiàn)稿)》意見(jiàn)的通知》,指導原則明確在非臨床研究中需要考慮以下因素(包括但不限于):細胞來(lái)源、生物學(xué)特性、作用機制;生產(chǎn)過(guò)程(如體外培養、 純化、誘導分化、擴增、基因修飾/改造等);終產(chǎn)品中不同分化階段細胞的數量/比例;終產(chǎn)品中可能殘留的非目的細胞(如未分化細胞、非預期分化細胞等)、非細胞成分(如雜質(zhì)/外源因子等);臨床擬用人群、給藥方式、預期的藥理作用靶部位;細胞在受者體內的遷移、定植、分化及存續能力;細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應;成瘤性和致瘤性的風(fēng)險等。對于指導原則中明確的考慮因素,盡早布局相關(guān)檢測。



        分子檢測


        基因表達分析:通過(guò)檢測細胞中特定的基因是否被激活或沉默,可以判斷細胞的類(lèi)型和狀態(tài)。例如,人胚干細胞和誘導多能干細胞通常表達一些多能性基因,如OCT4, SOX2, NANOG等,而人的成體干細胞則不表達或表達很低?;虮磉_分析的方法有很多,如實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、微陣列(microarray)、轉錄組測序(transcriptome sequencing)等。

        蛋白質(zhì)檢測:通過(guò)檢測細胞表面或內部的特定的蛋白質(zhì),可以判斷細胞的類(lèi)型和狀態(tài)。例如,人胚干細胞和誘導多能干細胞通常表達一些多能性標志物,如SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81等,而人的成體干細胞則不表達或表達很低。蛋白質(zhì)檢測的方法有很多,如免疫熒光染色(immunofluorescence staining)、流式細胞術(shù)(flow cytometry)、免疫印跡法(immunoblotting)等。

        表觀(guān)遺傳分析:通過(guò)檢測細胞中DNA或組蛋白的甲基化、乙?;刃揎?,可以判斷細胞的類(lèi)型和狀態(tài)。例如,人胚干細胞和誘導多能干細胞通常具有一種稱(chēng)為雙向啟動(dòng)子(bivalent promoter)的表觀(guān)遺傳特征,即同時(shí)存在著(zhù)激活和沉默基因的修飾,使得它們可以在適當的信號下快速分化為不同的細胞類(lèi)型。而人的成體干細胞則沒(méi)有這種特征。表觀(guān)遺傳分析的方法有很多,如甲基化敏感性限制酶消化法(methylation-sensitive restriction enzyme digestion)、雙鏈DNA免疫沉淀法(double-stranded DNA immunoprecipitation)、染色質(zhì)免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation)等。



        基本因素檢測


        細胞來(lái)源:細胞來(lái)源是指干細胞產(chǎn)品中的細胞是從哪里獲取的,例如胚胎、臍帶血、骨髓、脂肪等。細胞來(lái)源可以通過(guò)一些標志物來(lái)鑒定,例如表面抗原、轉錄因子、基因表達等。一些常用的檢測方法有流式細胞術(shù)、免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。

        生物學(xué)特性:生物學(xué)特性是指干細胞產(chǎn)品中的細胞具有的一些功能和性能,例如自我更新能力、增殖能力、分化能力、免疫原性等。生物學(xué)特性可以通過(guò)一些實(shí)驗來(lái)評估,例如集落形成實(shí)驗、細胞周期分析、分化誘導實(shí)驗、混合淋巴細胞反應等。

        作用機制:作用機制是指干細胞產(chǎn)品在體內發(fā)揮治療作用的原理和途徑,例如遷移、定植、分化、分泌因子等。作用機制可以通過(guò)一些模型和技術(shù)來(lái)探究,例如動(dòng)物模型、熒光標記、基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等。



        示例:干細胞來(lái)源檢測產(chǎn)品


        1. 采用一種基于引物探針的熒光報告系統,利用特異性的引物和探針來(lái)擴增和檢測不同來(lái)源的干細胞中的特征性基因或轉錄因子。例如,胚胎干細胞中的OCT4、NANOG、SOX2等,臍帶血干細胞中的CD34、CD133等,骨髓間充質(zhì)干細胞中的CD44、CD90等。

        2. 使用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),可以在同一反應管中同時(shí)檢測多個(gè)靶標,并使用不同顏色的熒光染料來(lái)區分。這樣可以提高檢測效率和準確性,同時(shí)節省試劑和樣品。

        3. 提供一套完整的反應體系和操作流程,包括模板提取、反應混合液配制、PCR反應條件設置、數據分析軟件等。用戶(hù)只需按照說(shuō)明書(shū)操作,即可獲得可靠的結果。

        4. 提供一系列的質(zhì)控品和標準品,用于驗證反應體系的性能和建立標準曲線(xiàn)。通過(guò)比較未知樣品的閾值循環(huán)數(CT值)和標準曲線(xiàn),可以計算出未知樣品中干細胞的起始拷貝數和來(lái)源。



        生產(chǎn)過(guò)程檢測

        基于微流控芯片的干細胞培養和純化系統,可以實(shí)現高效、精確和可控的干細胞培養和分離。利用微流控技術(shù),通過(guò)調節培養液的流速、溫度、氣體等參數,模擬干細胞的生理環(huán)境,促進(jìn)其增殖和分化。同時(shí)還可以利用微流控閥門(mén)和電泳技術(shù),根據干細胞的大小、形狀、電荷等特性,實(shí)現干細胞的純化和收集。

        基于核酸適配體的干細胞誘導分化,可以實(shí)現高效、簡(jiǎn)便和特異的干細胞誘導分化。利用核酸適配體技術(shù),通過(guò)篩選出能夠特異性結合干細胞表面受體的核酸分子,模擬生長(cháng)因子或細胞因子的作用,激活干細胞的信號通路,誘導其向目標細胞類(lèi)型分化。目的要求具有低毒性、低免疫原性、低成本等優(yōu)點(diǎn)。

        基于CRISPR/Cas9技術(shù)的干細胞基因編輯工具,可以實(shí)現高效、精確和靈活的干細胞基因修飾或改造。該工具利用CRISPR/Cas9技術(shù),通過(guò)設計能夠特異性識別目標基因序列的導向RNA(gRNA),結合Cas9核酸酶,實(shí)現對干細胞基因組的切割或插入。該工具可以用于增加或減少干細胞的功能基因,或者引入外源基因,改變干細胞的表型或功能。



        終產(chǎn)品檢測


        基于熒光活細胞成像儀的干細胞分化分析系統,可以實(shí)現高通量、高分辨率和動(dòng)態(tài)的干細胞分化過(guò)程的監測和定量。該系統利用熒光活細胞成像儀,通過(guò)設置不同的波長(cháng)和濾鏡,對干細胞分化過(guò)程中表達的特異性熒光蛋白進(jìn)行連續拍攝和記錄。通過(guò)對圖像進(jìn)行分析,可以計算出不同分化階段細胞的數量、比例、形態(tài)、遷移等參數。該系統可以用于評估干細胞分化效率、穩定性和一致性。

        基于流式細胞術(shù)的干細胞分化鑒定,可以實(shí)現快速、準確和特異的干細胞分化狀態(tài)的鑒定。利用流式細胞術(shù),通過(guò)使用不同的熒光標記抗體,對干細胞分化過(guò)程中表達的特異性表面標志物進(jìn)行檢測和計數。通過(guò)對數據進(jìn)行分析,可以確定干細胞分化為哪些細胞類(lèi)型,以及各種細胞類(lèi)型的數量和比例。最終用于評估干細胞分化質(zhì)量、純度和多樣性。

        基于單細胞轉錄組測序的干細胞分化譜系重建,實(shí)現高深度、高靈敏度和高分辨率的干細胞分化過(guò)程的解析和重建。利用單細胞轉錄組測序,通過(guò)對干細胞分化過(guò)程中每個(gè)單個(gè)細胞的全基因組表達水平進(jìn)行測定和比較。通過(guò)對數據進(jìn)行聚類(lèi)、降維、軌跡推斷等方法,揭示干細胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵基因、信號通路、轉錄因子等因素,以及各種分化階段之間的關(guān)系和轉換。最終用于評估干細胞分化機制、潛能和多樣性。



        非目的殘留檢測

        干細胞終產(chǎn)品中可能殘留的非目的細胞和非細胞成分是影響干細胞產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素,需要進(jìn)行嚴格的檢測和控制。

        非目的細胞:非目的細胞是指干細胞產(chǎn)品中不符合預期目標的細胞,例如未分化細胞、非預期分化細胞等。這些細胞可能會(huì )導致受者體內發(fā)生不良反應,如免疫排斥、炎癥、腫瘤等。

        細胞表面標志物檢測:利用特異性抗體或熒光染料,對干細胞產(chǎn)品中表達的特定細胞表面標志物進(jìn)行檢測,以區分不同類(lèi)型和狀態(tài)的細胞。例如,利用CD34、CD133等抗體,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的造血干細胞。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗等。

        基因表達檢測:利用特異性引物或探針,對干細胞產(chǎn)品中表達的特定基因或轉錄因子進(jìn)行檢測,以區分不同類(lèi)型和狀態(tài)的細胞。例如,利用OCT4、NANOG、SOX2等引物或探針,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的多能干細胞。一些常用的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、原位雜交、基因芯片等。

        非細胞成分:非細胞成分是指干細胞產(chǎn)品中除了目標細胞以外的其他成分,例如雜質(zhì)/外源因子等。這些成分可能會(huì )影響干細胞產(chǎn)品的質(zhì)量和穩定性,或者對受者體內造成污染或毒性。

        內毒素檢測:內毒素是一種由革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖,具有強烈的致炎和致死作用。內毒素可能會(huì )污染干細胞產(chǎn)品中使用的培養液、添加劑或器械等。

        微生物檢測:微生物是指干細胞產(chǎn)品中可能存在的細菌、真菌、病毒等微小生物,可能會(huì )導致干細胞產(chǎn)品的污染或受者體內的感染。



        免疫性原性


        細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應是影響干細胞產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素,需要進(jìn)行嚴格的檢測和控制。一些常用的檢測方法有:

        細胞的免疫原性:細胞的免疫原性是指干細胞產(chǎn)品中的細胞是否能夠被受者體內的免疫系統識別和攻擊,導致免疫排斥或耐受。細胞的免疫原性主要取決于細胞表面表達的主要組織相容性復合物(MHC)分子,以及其他共刺激分子、附屬分子等。細胞的免疫原性的檢測方法主要有:

        MHC分型:利用特異性抗體或探針,對干細胞產(chǎn)品中表達的MHC分子進(jìn)行檢測,以確定其與受者體內MHC分子的相似度或差異度。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、PCR-SSP、PCR-SSO等。

        共刺激分子和附屬分子檢測:利用特異性抗體或探針,對干細胞產(chǎn)品中表達的共刺激分子和附屬分子進(jìn)行檢測,以評估其對受者體內T細胞活化或抑制的影響。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。

        受者對細胞的免疫反應:受者對細胞的免疫反應是指干細胞產(chǎn)品在受者體內引發(fā)的免疫應答,包括體液免疫和細胞免疫兩種類(lèi)型。受者對細胞的免疫反應主要取決于干細胞產(chǎn)品與受者體內MHC分子的匹配程度,以及其他因素如給藥方式、劑量、頻率等。受者對細胞的免疫反應的檢測方法主要有:

        體液免疫檢測:利用特異性抗體或抗原,對受者血清中存在的針對干細胞產(chǎn)品中細胞或其成分的抗體進(jìn)行檢測,以評估其對干細胞產(chǎn)品在體內存活和功能的影響。一些常用的技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附試驗、熒光抗體試驗等。

        細胞免疫檢測:利用特異性抗原或抗體,對受者外周血單個(gè)核細胞(PBMC)中存在的針對干細胞產(chǎn)品中細胞或其成分的T細胞進(jìn)行檢測,以評估其對干細胞產(chǎn)品在體內存活和功能的影響。一些常用的技術(shù)有混合淋巴細胞反應、ELISPOT、流式細胞術(shù)等。


        成瘤性和致瘤性


        成瘤性和致瘤性的風(fēng)險是指干細胞產(chǎn)品中的細胞是否能夠在受者體內形成腫瘤或誘發(fā)腫瘤,導致嚴重的不良后果。成瘤性和致瘤性的風(fēng)險主要取決于干細胞產(chǎn)品中的細胞類(lèi)型、分化狀態(tài)、基因穩定性、免疫相容性等因素。

        細胞類(lèi)型和分化狀態(tài)檢測:利用特異性抗體或探針,對干細胞產(chǎn)品中表達的特定細胞類(lèi)型或分化狀態(tài)的標志物進(jìn)行檢測,以評估其是否具有成瘤或致瘤潛能。例如,利用OCT4、NANOG、SOX2等標志物,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的多能干細胞,這些細胞具有較高的成瘤性。利用p53、Rb、Bcl-2等標志物,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有癌變或易癌變的細胞,這些細胞具有較高的致瘤性。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。

        基因穩定性檢測:利用特異性引物或探針,對干細胞產(chǎn)品中存在的基因突變、缺失、重排等異常進(jìn)行檢測,以評估其是否影響細胞的正常功能或調控,導致成瘤或致瘤。例如,利用TP53、KRAS、EGFR等引物或探針,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與腫瘤相關(guān)的基因突變。利用FISH、CGH等技術(shù),檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與腫瘤相關(guān)的染色體異常。一些常用的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、FISH、CGH等。

        免疫相容性檢測:利用特異性抗體或抗原,對干細胞產(chǎn)品中表達的主要組織相容性復合物(MHC)分子進(jìn)行檢測,以評估其與受者體內MHC分子的匹配程度,以及其對受者體內免疫系統的影響。例如,利用HLA-A、HLA-B、HLA-C等抗體,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與受者相同或相似的MHC I分子,這些分子可以減少免疫排斥反應,但也可能增加腫瘤逃逸反應。利用HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等抗體,檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與受者不同或不相似的MHC II分子,這些分子可以增加免疫監視反應,但也可能增加免疫攻擊反應。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、PCR-SSP、PCR-SSO等。


        2023-10-16
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